อีเมล: info@tdha.or.th ฮอตไลน์: 081-806-1777 โทร: 02-312-3888
การตรวจโควิดด้วย วิธี RT-PCR
เทคนิค realtime RT-PCR วิธีนี้เป็นวิธีมาตรฐานที่องค์การอนามัยโลกแนะนำ และใช้กันอย่างแพร่หลาย เนื่องจากมีความไว ความจำเพาะสูง ทราบผลภายใน 2-3 ชั่วโมง ประมาณร้อยละ 90 ของชุดน้ำยาที่จำหน่ายทั่วโลก ใช้เทคนิคนี้ในการตรวจหาสารพันธุกรรมของเชื้อ SARS-CoV-2 ขั้นตอนการทดสอบคือ ใช้ชุดน้ำยาสกัดยีโนมของไวรัสซึ่งเป็นชนิด RNA จากตัวอย่างผู้ป่วย จากนั้นสังเคราะห์ RNA เป็น cDNA โดยอาศัยเอนไซม์ reverse transcriptase เพิ่มจำนวน DNA ส่วนที่ต้องการตรวจสอบด้วยน้ำยาที่มี polymeraseTag enzyme, primers และprobes ที่จำเพาะกับไวรัส SARS-CoV-2 และติดฉลากด้วยสีฟลูออเรสเซนต์โดยใช้เครื่องมืออัตโนมัติ (realtime PCR) ทำอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเพิ่มปริมาณ DNA และตรวจวัด DNAของไวรัสที่เพิ่มขึ้น ผ่านระบบ detection unit วัดความเข้มของแสงซึ่งประกอบด้วย emission filter ,excitation filter และ analysis software สำหรับคำนวณและวิเคราะห์ความเข้มของแสงฟลูออเรสเซนต์แสดงออกมาเป็นรูปกราฟหรือตัวเลขความเข้มของแสงในแต่ละรอบของปฏิกิริยา สามารถอ่านผลเป็นปริมาณไวรัส หรือพบ/ไม่พบไวรัส
ปัจจุบันมีชุดน้ำยาrealtime RT-PCR ออกวางจำหน่ายทั่วโลกมากกว่าร้อยยี่ห้อ ต่างกันด้วยprimers และ probes ที่ออกแบบมาจำเพาะต่อยีนที่ตำแหน่งต่างๆกัน เช่น บางบริษัท มีprimers และprobes ที่จำเพาะต่อ E ยีนของไวรัสโคโรนาในกลุ่ม Sarbecovirus ( SARS-CoV-1 และ SARS-CoV-2 ) รวมกับ primers และ probes ที่มีความจำเพาะกับ SARS-CoV-2 แต่ชุดน้ำยาโดยส่วนใหญ่มีเฉพาะ primers และprobes จำเพาะต่อยีน SARS-CoV-2 ที่ตำแหน่งต่างๆกันไปตั้งแต่ 1 จนถึง 3 ตำแหน่ง เช่น ORF- 1a, ORF1b และ ORF-1ab ที่ encode nonstructural protein (nsp) และส่วนที่ encode structural proteinได้แก่ S (spike), E (envelope), M (membrane) และ N (nucleocapsid) นอกจากนี้บางบริษัทได้ผลิตชุดน้ำยาพร้อมเครื่องทำปฏิกิริยา ที่เรียกกันว่า เครื่อง Fully automate เช่น เครื่อง Cobas SARS-CoV-2,Roche เครื่องมือจะทำงานได้เองอัตโนมัติตั้งแต่กระบวนการสกัดจนถึงการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรม ตรวจได้ตั้งแต่ 96-384 ตัวอย่างต่อรอบ
แม้ว่า realtime PCR จะเป็นวิธีที่ใช้แพร่หลาย แต่ยังต้องอาศัยเครื่องมือจำเพาะเช่นเครื่องสกัดสารพันธุกรรม เครื่องทำปฏิกิริยา realtime PCR และระดับความปลอดภัยของห้องปฏิบัติการที่เหมาะสม (BSL2enhanced) ปัจจุบันเทคโนโลยีการตรวจหาสารพันธุกรรมของเชื้อ SARS-CoV-2 ด้วยเทคนิค realtime RTPCR มีความก้าวหน้าอย่างรวดเร็ว การสกัดและการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมสามารถทดสอบเบ็ดเสร็จในหลอดน้ำยาเดียวกัน จึงลดการปนเปื้อนที่เป็นสาเหตุของการเกิดผลบวกปลอม (False positive) รวมถึงการลดเวลากระบวนทดสอบทำให้รายงานผลได้รวดเร็วขึ้น นอกจากนี้ยังใช้เครื่องมือขนาดเล็กเพียงเครื่องเดียว ที่สะดวกในการติดตั้ง ใช้พื้นที่เพียงเล็กน้อย เหมาะสำหรับการจัดตั้งในโรงพยาบาลหรือที่เรียกว่าการตรวจ ณ จุดดูแลผู้ป่วย (POCT: point of care testing) แต่ยังคงมีข้อจำกัดที่แต่ละรอบการทำงาน สามารถทดสอบตัวอย่างได้จำนวนน้อยหรือต่ำกว่า 10 ตัวอย่าง เช่น Xpert Xpress SARS-CoV-2, Cepheid ตรวจได้ 4ตัวอย่างต่อรอบใช้เวลา 35 นาที QIAstat-Dx Respiratory SARS-CoV-2 Panel, QIAGEN ใช้เทคนิคmultiplex realtime PCR ตรวจหาไวรัสและแบคทีเรียได้เพิ่มอีก 22 ชนิดโดยตรวจได้ 1 ตัวอย่างต่อรอบใช้เวลา 60 นาที และล่าสุด CovidNudge ที่บริษัท DNANudge ในประเทศอังกฤษได้ปรับรูปแบบจากชุดตรวจหา human DNA typing มาเป็นผลิตภัณฑ์ใหม่ที่มีชื่อทางการค้าว่า CovidNudge ประกอบด้วยDnaCartridge เป็นตลับทดสอบที่แบ่งออกเป็น 2 ส่วน คือ ส่วนสกัดตัวอย่าง (sample preparation ) และส่วนทำปฏิกิริยา realtime PCR (amplification unit) เมื่อใส่ไม้สวอปเข้าในตลับแล้วจึงนำไปวางในกล่องNudgeBox เพื่อเริ่มกระบวนการทดสอบ CovidNudge มีความไว (sensitivity) ประมาณ 94% และความจำเพาะ (specificity) ประมาณ 100% เมื่อเทียบกับ standard realtime RT-PCR โดยใช้เวลา 90 นาทีในการตรวจ 1 ตัวอย่าง
ที่มา : กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข
